6. Выводы

В этой статье представлен набор критериев проектирования для оценки длины и обтекаемой формы конической секции, подверженной реалистичным конструктивным ограничениям, которые объединяют сложные характеристики системы полость / транспортное средство. при автоколебании суперкавитационных аппаратов. Основные выводы заключаются в следующем: (1) Согласно уравнению (43) частота автоколебаний КА пропорциональна скорости движения, обратно пропорциональна физическим размерам, пропорциональна квадратному корню из производной по положению коэффициента поперечной силы, и тесно связан с расположением центра масс.(2) В случае автоколебаний длина конического участка может быть рассчитана путем определения максимальной амплитуды угла Эйлера. Устойчивость КА тесно связана с положением центра масс. Большее плечо силы строгания может обеспечить больший допустимый диапазон для устойчивости движения. (3) Обтекаемая форма конической секции может быть спроектирована с использованием метода равной площади поперечного сечения для стабилизации потока газа и создания гладкой суперполости.

Результаты экспериментов показывают, что представленная методика расчета формы конического сечения подходит для КА.

Приложение

Автоколебательные характеристики КА . Компоненты расстояния и выражаются как

Анализ автоколебаний во временной области . Коэффициенты и выражаются как

Длина конической секции . Коэффициенты, и выражаются как

Обтекаемая форма конической секции . Коэффициенты, и выражаются как

Номенклатура

Доступность данных

Данные, использованные для подтверждения выводов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (гранты № 51679202 и 51579209).

Коническая форма липидов DIM способствует инфицированию макрофагов Mycobacterium tuberculosis

Димикоцерозаты фтиоцерина (DIM / PDIM) представляют собой высокогидрофобные липиды, содержащие 2 множественные метил-разветвленные цепи жирных кислот (рис.1 А ). Эти липиды в основном обнаруживаются в клеточной стенке патогенных микобактерий и особенно много у возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) (1). Они составляют один из основных факторов вирулентности Mtb (2). В самом деле, штаммы Mtb , лишенные DIM, резко ослаблены (3) и с большей вероятностью будут уничтожены ранним легочным врожденным иммунным ответом (4), когда бактерии сталкиваются с макрофагами.Недавние исследования показали, что DIM модулируют метаболизм макрофагов (5) и иммунные функции (6, 7). В частности, DIM повышают способность Mtb инфицировать макрофаги путем модуляции фагоцитоза (8), фундаментального иммунного процесса, включающего ремоделирование мембран. Однако то, как DIMs вмешиваются в эти клеточные процессы, остается плохо изученным.

Mtb синтезирует большое количество факторов липидной вирулентности, большинство из которых являются амфипатическими гликолипидами. Эти гликолипиды действуют через свои сахаридные домены как потенциальные лиганды для мембранных рецепторов на макрофагах, вызывая фагоцитоз Mtb (9).В отсутствие сахаридной части DIM не может участвовать в таких взаимодействиях. Напротив, молекулярный механизм с участием DIM может быть связан с глобальным влиянием на физические свойства мембраны клетки-хозяина, такие как ее текучесть и организация (8). Изменение таких свойств может быть успешной стратегией для бактерий по модуляции функций эукариотических клеток. Некоторые типы патогенных микобактерий применяют эту стратегию, чтобы влиять на судьбу своих клеток-хозяев. Например, Mycobacterium ulcerans продуцирует липидоподобный эндотоксин миколактон, который взаимодействует с мембранами хозяина и нарушает их липидную организацию (10).Кроме того, патогенные микобактерии используют липоарабиноманнан для проникновения в нейтрофилы и предотвращения образования фаголизосом (11).

Биофизические свойства DIM в биологических мембранах еще не охарактеризованы на молекулярном уровне. В частности, неясно, может ли такой сложный и большой липид быть включен в простой фосфолипидный бислой и какую форму DIM должен принимать в такой мембране. Форма липидных молекул, определяемая структурными свойствами (12), такими как размер их головной группы, длина ацильной цепи и степень ненасыщенности ацильной цепи, может существенно повлиять на структуру и организацию биологических мембран (13, 14).Изучение того, как молекулярная форма липидов может дезорганизовать липидные бислои и как это может быть связано с биологической функцией, все еще остается сложной задачей (15). Это требует увязки структуры молекул и их биофизических действий на наноуровне с макроскопическими последствиями для функций клетки. Чтобы добиться этого для DIM, мы разработали междисциплинарный подход, сочетающий многомасштабное моделирование молекулярной динамики (MD), твердотельный ЯМР и эксперименты по клеточной биологии. Это показало, как молекулярная форма DIM может влиять на мембраны макрофагов, способствуя фагоцитозу.

Результаты

DIM переносятся на мембраны клеток-хозяев во время заражения макрофагами.

Во-первых, мы использовали масс-спектрометрию с лазерной десорбционной ионизацией с использованием матрицы и временем пролета (MALDI-TOF), чтобы оценить, включается ли DIM, добавленный к клеткам-хозяевам, в их мембраны. Клетки макрофагов человека (THP-1) обрабатывали очищенным DIM, и масс-спектр экстрагированных липидов сравнивали со спектром очищенного DIM. Структура DIM состоит из длинной цепи фтиоцерина (3-метокси, 4-метил, 9,11-дигидроксигликоль), этерифицированного 2 микоцерозовыми кислотами (длинноцепочечные множественные метил-разветвленные жирные кислоты) (рис.1 А ). В соответствии с базой данных MycoMass (16), масс-спектр очищенного DIM характеризуется кластером псевдомолекулярных ионов [M + Na] ⁺ между m / z = 1,305 и m / z = 1,501 с шагом m / z = 14 (рис. 1 B ), что отражает изменчивость длины цепи и метилирования молекулы. Мы наблюдали, что спектр экстрагированных липидов из клеток THP-1, обработанных DIM, показал серию пиков, очень сходную с таковой для очищенного DIM (рис.1 B ). Эти пики отсутствовали в спектре липидных экстрактов из необработанных клеток ( SI Приложение , рис. S1 A ). Следовательно, экзогенно доставленный DIM может быть вставлен в мембраны макрофагов и обнаруживается с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.

Затем мы исследовали, может ли DIM переноситься из оболочки Mtb на мембраны макрофагов во время инфекции. Чтобы проверить это, мы инфицировали макрофаги THP-1 штаммом h47Rv Mtb дикого типа (WT) в течение 2 ч при множественности инфицирования (MOI) 15: 1.Через 40 часов после инфицирования мембранная фракция инфицированных макрофагов показала масс-спектр, подобный липидной сигнатуре DIM, выделенной из инокулята h47Rv (фиг. 1 C ). Мы заметили отчетливый сдвиг в сторону более длинных цепочек DIM, что согласуется с сообщенным увеличением молекулярной массы DIM во время заражения Mtb (17). Остаточное бактериальное загрязнение фракций мембран макрофагов составило менее 1500 колониеобразующих единиц (КОЕ), что значительно ниже порога обнаружения DIM, экстрагированного непосредственно из бактерий (между 10 ⁵ и 10 ⁷ КОЕ) ( SI Приложение , рис.S1 B ). Таким образом, наши данные убедительно подтверждают модель, согласно которой DIM передается от Mtb к мембранам инфицированных макрофагов.

Чтобы проверить, требуется ли воздействие DIM на поверхность Mtb для их переноса на мембраны макрофагов, мы инфицировали макрофаги мутантным штаммом (h47RvΔ lppX ), лишенным LppX, липопротеина, необходимого для перемещения DIM во внешнюю среду. мембрана МТБ (18). После заражения мы не наблюдали типичного масс-спектра DIM в мембранной фракции клеток, инфицированных h47RvΔ lppX (рис.1 С ). Мы подтвердили, что штаммы дикого типа и мутантные штаммы продуцировали аналогичные количества DIM ( SI Приложение , рис. S1 C ).

Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что молекулы DIM действительно переносятся на мембраны макрофагов во время инфекции, при условии, что они подвергаются воздействию на поверхность M. tuberculosis .

DIM встраиваются в двухслойную мембрану за счет принятия конической формы.

Учитывая их длинные алифатические цепи и их общие гидрофобные свойства, мы стремились понять, как DIM может физически размещаться в двухслойной мембране.Мы использовали подход многомасштабного моделирования, чтобы получить представление о конформации такого сложного липида, встроенного в простой фосфолипидный бислой.

Во время инфицирования макрофагами Mtb продуцирует DIM с более высокой молекулярной массой, чем в неинфекционных условиях (17) (рис. 1 C ). Поэтому мы смоделировали структуру молекулы DIM с молекулярной массой 1436 Да (соответствует пику м / z = 1459, см. Звездочку на рис. 1 C ): i.е., имеющий длину цепи и число метилирований, соответствующие m = 18, n = 17 и p = 4 (рис. 1 A ). Затем 800 нс моделирования атомистической молекулярной динамики (МД) одиночной молекулы DIM в липидном бислое 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфохолин (POPC) показали, что DIM глубоко встроен в мембрану. и может проходить между двумя противоположными створками (Рис. 2 A ). Атомы кислорода DIM предпочтительно оставались вблизи сложноэфирных связей POPC, в то время как ацильные цепи вытягивались в гидрофобное ядро ​​мембраны.Очень длинные ацильные цепи (содержащие до 27 атомов углерода) препятствовали ограничению молекулы DIM одним листом. Вместо этого, DIM, по-видимому, размещается внутри фосфолипидного бислоя за счет удлинения этих цепей в пространстве между листами (см. Профиль плотности на Fig. 2 A ).

Положение и форма одиночной молекулы DIM в бислое POPC. ( A , Top Inset ) Атомистическое моделирование молекулы DIM (в серой лакричнице), показывающее ее переход от одного листочка бислоя POPC к противоположному.Атомы кислорода DIM представлены фиолетовым цветом, атомы фосфора POPC отображаются голубым цветом, а атомы кислорода POPC — розовым. ( A , Bottom Left ) Пурпурным цветом показана эволюция z-положения центра масс атомов кислорода DIM в ходе атомистического моделирования. Светло-голубым цветом показано усредненное z-положение атомов фосфора в молекулах POPC. ( A, , , нижний правый угол, ) Плотности положений липидных и фосфатных групп DIM, показывающих положение встроенного DIM в бислое.( B ) Крупнозернистая модель молекулы DIM (подробности см. В материалах и методах и SI, приложение , рис. S3). ( C ) Эволюция N0 и последних частиц C1 на фрагментах фтиоцерина (пурпурного и розового цвета соответственно) в ходе моделирования компьютерной графики. На этом графике показана частица C1, удерживаемая вокруг межлистового пространства, в то время как частица N0 оставалась вблизи атомов кислорода POPC. ( Верхняя вставка ) Переход DIM (серого цвета) от одной листовки к другой во время моделирования компьютерной графики.(, правая вставка ) Плотности липидных и фосфатных групп DIM. ( D ) 2D-проекции плотности каждой конечности для молекул DIM и POPC в плоскости мембраны x — y (компьютерное моделирование) (см. Также приложение SI , рис. S5, отображающее плотности для атомистического моделирования), подчеркивая коническую форму DIM и цилиндрическую форму POPC, соответственно. Частицы, изображенные зеленым цветом, использовались для центрирования молекул.

Для дальнейшего изучения динамики молекулы DIM в мембране мы разработали крупнозернистую (CG) модель (рис.2 B ) на основе силового поля MARTINI ( Материалы и методы и SI Приложение , рис. S3). Это силовое поле хорошо приспособлено для моделирования большого разнообразия липидов и их действия на мембраны и белки (19, 20). CG моделирование одиночной молекулы DIM в бислое POPC подтвердило, что DIM удлиняет свои длинные ацильные цепи между двумя листочками, как видно в атомистическом моделировании (Fig. 2 B и C ). Используя CG-моделирование, мы смогли расширить моделирование до более длительных временных масштабов, чтобы увидеть множественные транслокации DIM от одного листочка к другому (рис.2 С ). Затем мы увеличили количество молекул DIM до молярного отношения DIM к POPC около 7% ( SI Приложение , рис. S4). При низких концентрациях (1%, 2% и ~ 4%) молекулы DIM свободно диффундируют внутри бислоя, в то время как при 7% они начинают сильно взаимодействовать друг с другом и образовывать агрегаты между двумя листочками. Такое поведение также наблюдается как экспериментально, так и вычислительно для молекул со схожими структурными особенностями, таких как триглицериды (21, 22).

Далее мы попытались понять, как положение ацильных цепей DIM в пространстве между листами влияет на его общую форму.Для этого мы спроецировали положения липидных конечностей на двумерную (2D) плоскость мембраны (рис. 2 D ). При центрировании молекулы на стыке цепей это выявило очень большие движения концов 3-ацильной цепи, в то время как самый полярный конец цепи фтиоцерина оставался в основном статичным. Для POPC аналогичная проекция показала совершенно другое поведение со сравнимой плотностью как для головной группы, так и для концов гидрофобных ацильных цепей (рис.2 D ). Сопоставимые результаты были получены при атомистическом моделировании ( SI Приложение , рис. S5). Эти результаты могут быть связаны с эффективной формой каждой молекулы: хотя известно, что POPC имеет цилиндрическую форму, в соответствии с нашим моделированием, которая подходит для образования плоских липидных мембран, наши результаты показали, что молекулы DIM принимают сильно коническую форму в липидный бислой.

DIM управляют формированием недислойных мембранных структур в липидной смеси DOPE / SOPC.

Эта коническая молекулярная форма DIM может иметь важные последствия для организации DIM-содержащих мембран. Действительно, известно, что конические липиды дестабилизируют фазу ламеллярной мембраны (L _α ) и способствуют появлению недислойной перевернутой гексагональной фазы (H _II ) (23). Переход от фазы L _α к фазе H _II можно изучить с помощью спектроскопии P-ЯМР ³¹ , отслеживая спектры ЯМР при повышении температуры (материалы и методы , ).Мы использовали ЯМР-спектроскопию с вращением под магическим углом (MAS) для повышения чувствительности. Использована смесь фосфолипидов 1,2-диолеоил- sn -глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ) и 1-стеароил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфохолин (СОФХ) (24). для ряда липидов, чтобы изучить их склонность к индуцированию недислойных фаз (25, 26). Для изучения влияния DIM мы использовали липидные мембраны, изготовленные из смеси DOPE и SOPC в соотношении 3: 1 (моль / моль) (материалы и методы , ).При таком липидном составе мембраны оставались в фазе L _α при температурах до 322 К (рис. 3 A и C ). Однако включение 5% DIM в липидную смесь дестабилизировало фазу L _α и индуцировало переход от фазы L _α при низкой температуре (284 К) (рис. 3 A ) к фазе H _II . конфигурация фаз при высокой температуре (310 К и 322 К) (рис. 3 A ), о чем свидетельствуют спектры P-ЯМР ³¹ .Таким образом, DIM дестабилизируют фазу L _α в наших модельных мембранах и способствуют переходу в фазу H _II .

DIM индуцируют фазы H _II для липидной смеси ДОФЭ / СОФХ (3: 1, моль / моль). ( A ) ³¹ P-ЯМР-спектры при различных температурах для DOPE / SOPC (3: 1, моль / моль) без DIM или с 5% DIM. В спектрах P-ЯМР MAS ³¹ каждая вращающаяся боковая полоса состоит из пика DOPE и пика SOPC. ( B ) Крупнозернистые модели фазового перехода в DOPE / SOPC (3: 1, моль / моль) без DIM или содержащие 5% DIM.Повышение температуры приводит к образованию трубчатых структур для систем, содержащих DIM, в то время как системы без DIM остаются полностью пластинчатыми. Показанные снимки сделаны в конце моделирования продолжительностью 3 мкс. Молекулы SOPC окрашены в красный цвет. Молекулы ДОФЭ окрашены в синий цвет. Молекулы DIM окрашены в желтый цвет. Молекулы воды представлены синей поверхностью. ( C ) Спектральная деконволюция спектров P-ЯМР ³¹ , дающая процентное содержание фазы L _α как функцию температуры для DOPE / SOPC (3: 1) без DIM (оранжевый и зеленый шестиугольники) и с добавлением 5% DIM (красный и синий треугольники).В случае 5% DIM фазовый переход можно аппроксимировать сигмоидой (красная и синяя линии). ( D ) Фазовые переходы SOPC и DOPE, рассчитанные на основе моделирования CG-MD для 2,5% и 5% DIM. Для смеси DOPE / SOPC с 5% DIM мы удалили выбросы при 330 K из подгонки кривой на основе статистических тестов ( SI Приложение , Дополнительный текст ).

В качестве дополнительного подхода к мониторингу способности DIM индуцировать недислойные фазы, мы выполнили моделирование CG-MD.Этот метод особенно хорошо подходит для изучения липидных фазовых переходов в липидах (27, 28) и полимерах (29, 30). Мы смоделировали набор из 4 липидных бислоев идентичного состава (3: 1 DOPE / SOPC), как в экспериментах ³¹ P-ЯМР, для температур в диапазоне от 280 K до 350 K (подробности см. В «Материалы и методы» ). Подобно экспериментам ³¹ P-ЯМР, мембраны оставались в ламеллярной фазе в отсутствие DIM ( SI Приложение , рис. S6), но температурно-зависимый переход происходил при добавлении 5% DIM (рис. .3 В ). Это моделирование позволяет глубже понять молекулярный процесс фазового перехода H _II в присутствии DIM. При низких температурах молекулы DIM образовывали агрегаты в межлистовом пространстве (фиг. 3 B , 280 K), как также видно в бислое POPC ( SI, приложение , фиг. S4). Повышение температуры привело к формированию слитых стеблей, липидных структур в форме песочных часов, образованных между соседними бислоями. DIM собраны в этих стеблях, чтобы удлинить их большие гидрофобные хвосты (Movie S1).Эта агрегация стабилизировалась и помогла увеличить ширину стеблей, что в конечном итоге привело к образованию трубчатых, заполненных водой мембранных структур (рис. 3 B , 310 K). При еще более высоких температурах (320 К и выше) молекулы DIM свободно диффундируют в гидрофобном ядре мембраны, таким образом стабилизируя конфигурацию H _II (рис. 3 B , 320 K и Movie S1).

Мы осуществили деконволюцию спектров P-ЯМР ³¹ , записанных между 282 K и 322 K с шагом 2 K для DOPE / SOPC (3: 1) с 5% DIM, используя набор параметров, полученных из базовых наборов данных (материалы ). и методы и SI, приложение , таблица S2).Химические сдвиги ³¹ P DOPE и SOPC различны. Таким образом, каждая вращающаяся боковая полоса в наших спектрах состояла из 2 разрешенных пиков (рис. 3 A ), что позволило нам в одном спектре независимо проанализировать процентное содержание фаз L _α и H _II для DOPE и для SOPC. Для обоих липидов мы наблюдали непрерывный переход от L _α к фазе H _II , описываемой сигмовидом (рис. 3 C и SI, приложение , таблица S3 и дополнительный текст ).Температуры средней точки фазового перехода (T ₅₀ ) составляли 303,5 К (± 0,4) для DOPE и 305,3 К (± 0,5) для SOPC. Следует отметить, что фазовые переходы молекул SOPC и DOPE не являются независимыми друг от друга. Наблюдаемая небольшая разница в 2 ° C отражает тенденцию молекул DOPE накапливать в неламеллярных доменах больше, чем молекулы SOPC, тенденцию, наблюдаемую в большинстве тестируемых условий ( SI Приложение , Таблица S3). Этот результат согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими, что конический DOPE предпочитает фазу H _II , в отличие от липидов цилиндрической формы POPC (31), а также может быть связан с сортировкой липидов в зависимости от кривизны (32, 33 ).В моделировании CG-MD мы оценили процентное содержание фазы L _α как функцию температуры по распределению углов наклона липидов ( SI Приложение , Дополнительный материал ) для SOPC и DOPE (Рис. 3 D ). Здесь мы также наблюдали непрерывные фазовые переходы, которые соответствовали сигмоиде, со средней температурой перехода ~ 308 К ( SI, приложение , таблица S3), что в целом согласуется с экспериментами ³¹ P-ЯМР.

CG-MD моделирования показали, что первая стадия механизма, посредством которого DIMs управляет фазовым переходом L _α -to-H _II , включает их агрегацию в мембранных стеблях. Следовательно, можно ожидать, что блокирование образования стеблей снизит эффект DIM. Чтобы проверить это и подтвердить нашу гипотезу, мы заменили фракцию SOPC на лизофосфатидилхолин (lysoPC), липид, который, как известно, препятствует образованию слитных стеблей (34, 35). ³¹ P-ЯМР эксперименты на липосомах DOPE / SOPC / lysoPC (75: 25: 0), (75: 20: 5) и (75:15:10), каждая из которых содержит 2.5% DIM, выявило повышение температуры средней точки перехода T ₅₀ ( SI Приложение , рис. S8) с увеличением процентного содержания lysoPC, что подчеркивает уменьшение эффекта DIM, когда образование слитного стебля подавляется. Затем мы выполнили компьютерное моделирование, чтобы понять молекулярный процесс. В соответствии с экспериментом ЯМР включение lysoPC в моделирование увеличило значение T ₅₀ ( SI, приложение , фиг. S8, , A ). На основе этого моделирования мы заметили, что эффект lysoPC не включает прямого взаимодействия с DIM, поскольку lysoPC распространяется по мембранам ( SI Приложение , рис.S8 B ). Действительно, эксперименты ³¹ P-ЯМР на DOPE / SOPC (5: 1, моль / моль), которые демонстрируют переход от L _α к H _II без DIM, также показали увеличение T ₅₀ при замене фракции SOPC на lysoPC ( SI Приложение , рис. S7). Таким образом, ограничение образования стеблей снижает способность DIM эффективно управлять образованием недислойных мембранных структур.

Влияние DIM на более сложные липидные смеси.

Смесь ДОФЭ / СОФХ (3: 1, моль / моль) может легко перейти в инвертированную гексагональную фазу за счет включения посторонних конических липидов.Чтобы изучить действие липидов DIM в более естественных, нейтральных к кривизне системах, мы также исследовали 2 различные липидные смеси. Сначала мы выполнили ³¹ P-ЯМР-эксперименты на липосомах 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфоколина (POPC) / пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфоэтаноламина (POPE) / холестерин / сфингомиелин (молярное соотношение 4: 3: 2: 1), композиция, выбранная для приближения к мембране макрофагов (36). В исследованном диапазоне температур (от 284 К до 324 К) мы не наблюдали перехода в фазу H _II для этой смеси ни без ДИМ, ни с включением 2.5% липидов DIM ( SI Приложение , рис. S9 A ). Интересно, что моделирование CG-MD предсказало, что даже с 5% липидов DIM полный переход H _II будет достигнут только при очень высоких температурах (370 K и выше) ( SI Приложение , рис. S9 B ). Затем мы исследовали смесь POPE / холестерин / сфингомиелин (молярное соотношение 7: 2: 1). Ожидалось, что эта система останется пластинчатой ​​во всем исследованном диапазоне температур (от 284 K до 324 K), поскольку полный переход H _II POPE, основного компонента этой смеси, достигается только при ∼350 K (37).Действительно, спектры ^31, P-ЯМР показали только ламеллярную фазовую конфигурацию без DIM ( SI, приложение , рис. S10, , A ). Однако включение 5% DIM в эту систему привело к переходу от L _α к H _II в диапазоне от 310 К до 324 К ( SI Приложение , рис. S10 B ) с средней точкой. температура при 318 К (± 0,16). Моделирование CG-MD также показало переход между 310 K и 320 K с добавлением 5% липидов DIM, в то время как смесь липидов без липидов DIM оставалась в полностью ламеллярном состоянии для этого диапазона температур ( SI Приложение , рис.S10 C ).

Путем анализа моделирования CG-MD мы исследовали, как добавление липидов DIM может изменить биофизические свойства ламеллярных систем. С этой целью мы сначала рассчитали мембранное латеральное давление бислоя POPC с различными концентрациями DIM ( SI Приложение , рис. S4 B ). Увеличение концентрации липидов DIM изменило профиль давления в системе. Изменение давления в центре бислоя подчеркивает расположение липидов DIM между двумя створками.Это может помочь снизить напряжение упаковки других конических липидов, таких как липиды фосфоэтаноламина (PE), что, в свою очередь, может снизить энергетические барьеры для образования гексагональной фазы. Таким образом, липиды DIM могут создавать пространственно неоднородное распределение различных липидов. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выполнили CG-MD моделирование мембранного пластыря размером 28 × 28 нм ² , состоящего из смеси POPC / POPE / холестерина / сфингомиелина (молярное соотношение 4: 3: 2: 1) с добавлением 2,5% или 5% липидов DIM.Для обеих концентраций мы наблюдали обогащение POPE вокруг агрегатов DIM (рис. 4).

DIM в липидной смеси POPC-POPE-холестерин-сфингомиелин. Моделирование участка 28 × 28 нм ² макрофагоподобной мембраны, состоящей из POPC / POPE / холестерина / сфингомиелина (соотношение 4: 3: 2: 1) при 310 K с 5% DIM ( A ) или 2,5% от DIM ( B ). Для каждой системы в конце 10 мкс моделирования 1 или несколько агрегатов формировались в центре бислоя.Здесь мы ориентируемся на самый крупный агрегат. ( верхняя иллюстрация ) DIM агрегируется после 10 мкс моделирования. Молекулы POPC окрашены в красный цвет. Молекулы POPE окрашены в синий цвет. Молекулы холестерина окрашены в зеленый цвет. Молекулы сфингомиелина окрашены в фиолетовый цвет. Молекулы DIM окрашены в желтый цвет. ( второй и третий ряд ) Профиль плотности для обеих створок (вид сверху мембраны) липидов DIM и POPE, полученный центрированием агрегатов DIM для последних 2.5 мкс. Пунктирные линии в целом определяют периферию агрегатов DIM, где липиды POPE имеют тенденцию к обогащению, в то время как они кажутся истощенными в центре агрегата.

В целом комбинация моделирования ³¹ P-ЯМР и CG-MD показала способность липидов DIM нарушать организацию мембраны и способствовать фазовому переходу от ламеллярной к инвертированной гексагональной фазе. Молекулярный механизм включает начальную агрегацию липидов DIM, которая затем может управлять образованием и стабилизацией слитых стеблей, что в некоторых случаях приводит к полной дестабилизации ламеллярной фазы в пользу инвертированной гексагональной фазы.

Высокая способность DIM индуцировать недислойную фазу по сравнению с другими липидами.

Мы сравнили способность (эффективность) DIM индуцировать фазу H _II для смеси DOPE / SOPC (3: 1, моль / моль) со способностью липидов с различными структурными особенностями, используя ³¹ P-ЯМР. Сначала мы проверили влияние концентрации DIM на образование фазы H _II . Фиг. 5 B показывает, что уменьшение концентрации DIM до 2,5% и 1% все еще приводит к образованию полной фазы H _II , хотя и при более высокой температуре.Повышенная температура средней точки перехода (рис. 5 B ) выявляет зависимость «доза-реакция», которая также наблюдается при моделировании CG-MD (рис. 3 D ). Затем мы проверили действие триглицерида трипальмитина (рис. 5 A ), который, как и DIM, имеет 3 ацильные цепи. Однако включение 2,5% или 5% трипальмитина не вызывало полного фазового перехода H _II (фиг. 5 B ). Таким образом, влияние DIM на формирование небилетической структуры, по-видимому, не связано однозначно с его трехногой структурой.

Сравнение активности DIM по индукции небислойной фазы с липидами различной формы. ( A ) Молекулярные структуры триацилглицерина (ТАГ) трипальмитина и 1,2-дилинолеоил- sn -глицеро-3-фосфоэтаноламина (DLiPE). ( B ) Эволюция фазового перехода L _α -в-H _II для молекул ДОФЭ как функция температуры для ДОФЭ / СОПК (3: 1), содержащих различные концентрации DIM, DLiPE и TAG ( см. также SI Приложение , рис.S11 для соответствующих кривых для молекул SOPC). Для наглядности планки погрешностей опущены. Как видно на рис. 3, ошибка составила ± 5%. Серая полоса представляет точки, полученные из спектров, выделенных в C . ( C ) ³¹ P-ЯМР-спектры липидных смесей, содержащих ТАГ, DLiPE или DIM, при 320 К. Вторая полоса вращения (4 кГц), которая сильно связана с эволюцией фазы L _α , увеличено в Top . Для сравнения черный пик изображает вторую полосу вращения DOPE / SOPC (3: 1) при 320 К.

Мы наконец проанализировали способность 1,2-дилинолеил- sn -глицеро-3-фосфоэтаноламин (DLiPE) индуцировать фазовый переход L _α -в-H _II и сравнили его с DIM. Ожидается, что с 2 двойными связями в каждой ацильной цепи (рис. 5 A ) DLiPE будет сильным усилителем образования гексагональной фазы (38). При 5% DLiPE мы наблюдали полный фазовый переход H _II уже при 322 K (рис.5 B и C ) и температуре средней точки перехода для DOPE 316 K (± 0.4). Однако это значение выше, чем для 5% DIM (303,5K ± 0,4), 2,5% DIM (304,5K ± 0,5) и даже 1% DIM (311,3K ± 1,0) ( SI Приложение , Таблица S3). Таким образом, молекулы DIM являются сильными индукторами недислойных фаз даже при низких концентрациях.

Форма липидов может быть оценена путем изучения обращенной гексагональной фазы в различных смесях липидов (38). Здесь, используя температуру фазового перехода L _α -в-H _II в качестве меры для оценки конической формы липидов, мы ранжировали форму различных молекул: DIM были сильно коническими, а DLiPE были менее коническими, в то время как трипальмитины были наименее коническая.

Форма липида модулирует проникновение частиц

В наших предыдущих экспериментах мутант с дефицитом DIM h47Rv ΔppsE , по-видимому, инфицировал макрофаги с меньшей эффективностью, чем штамм WT. Покрытие этих DIM-дефицитных мутантных бактерий DIM восстанавливало фенотип WT, в то время как покрытие мутантов трипальмитином не имело эффекта (8). Эти результаты теперь могут быть связаны с их соответствующей конической формой: сильно конической для DIM и менее конической для трипальмитина.Чтобы проверить, действительно ли именно коническая форма DIM помогает Mtb вторгаться в макрофаги, мы в сравнении оценили влияние экзогенно добавленного DIM и различных других липидов на способность этого мутанта вторгаться в макрофаги, полученные из моноцитов человека (hMDM). к штамму WT ​​h47Rv (рис. 6 A ). Мы подтвердили, что мутант с дефицитом DIM инфицировал меньший процент макрофагов, чем штамм WT (фиг. 6 B и C ). Предварительная обработка макрофагов DIM восстанавливала процент инфицированных клеток до уровня, сопоставимого с уровнем, наблюдаемым для штамма WT h47Rv в необработанных макрофагах (рис.6 B и C ). Примечательно, что обработка макрофагов коническим фосфолипидом POPE также увеличивала процент макрофагов, инфицированных мутантом h47RvΔ ppsE , тогда как обработка цилиндрическим липидом POPC не давала значительного эффекта (фиг. 6 C ). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что коническая форма DIM, которая индуцирует межслойные мембранные структуры, увеличивает эффективность Mtb для инфицирования макрофагов.

Форма липидов модулирует проникновение мутанта MtbΔ ppsE и зимозана в макрофаги.( A ) Макрофаги инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч с липидным растворителем (Ø) или липидами 70 мкМ (DIM, POPC и POPE), а затем подвергали воздействию GFP-экспрессирующего h47Rv WT или ΔppsE (MOI 10: 1) за 1 ч. Затем клетки фиксировали и обрабатывали для количественного определения инфицированных макрофагов с помощью флуоресцентной микроскопии. ( B ) Типичные изображения флуоресцентной микроскопии необработанных или DIM-обработанных макрофагов, окрашенных WGA (мембранный маркер, синий) и инфицированных GFP-экспрессирующим h47Rv WT или Δ ppsE (зеленый).(Масштаб: 30 мкм.) ( C ) Гистограмма представляет процент макрофагов, инфицированных Δ ppsE в обработанных липидами и необработанных макрофагах, выраженный по отношению к WT h47Rv (100%). ( D ) Макрофаги инкубировали с растворителем (Ø) или липидами, а затем вводили в контакт на 1 час с частицами зимозана (MOI 30: 1). ( E ) Процент макрофагов, инфицированных зимозаном, в необработанных клетках или клетках, обработанных липидами. Значения выражены относительно поглощения зимозана необработанными клетками (100%).Значения представляют собой средние значения ± SEM от 8 до 10 отдельных экспериментов. Была оценена значимость разницы в процентном отношении инфицирования макрофагами между h47Rv WT и Δ ppsE или между необработанными и обработанными липидами клетками: * P <0,05; ** P <0,015.

Чтобы определить, ограничивается ли этот эффект DIM на макрофаги инфекцией Mtb , мы исследовали влияние DIM и других липидов на поглощение зимозана (рис. 6 D ), грибкового полисахарида, часто используемого для изучения неопсонических заболеваний. фагоцитоз (39).Мы обнаружили, что преинкубация макрофагов с DIM также увеличивала поглощение зимозана макрофагами по сравнению с необработанными условиями, как и преинкубация с POPE, но не с POPC (рис. 6 E ). Эти данные показывают, что DIM и другие конические липиды обычно способствуют фагоцитозу макрофагами.

Обсуждение

В то время как перенос липидов от Mtb к мембранам макрофагов во время инфекции был продемонстрирован для гликолипидов (40), это никогда не было показано для DIM.Используя масс-спектрометрию MALDI-TOF, мы установили, что молекулы DIM, экспонированные на оболочке Mtb , действительно переносятся на мембраны макрофагов во время инфекции (рис. 1). Мы предполагаем 2 механизма, которые могли бы объяснить этот процесс. Обмен DIM может происходить путем прямого контакта между поверхностью бактерий и мембраной макрофага в местах контакта. Такой прямой обмен холестерина и холестерин-гликолипидов наблюдался между Borrelia burgdorferi и клетками HeLa (41).Альтернативно, DIM может транспортироваться в мембранах внеклеточных везикул, которые, как известно, выводятся из организма Mtb и другими микобактериями (42), с последующим слиянием этих везикул с плазматической мембраной макрофагов. Липидный обмен, опосредованный слиянием везикул, был показан для B. burgdorferi (41) и для Pseudomonas aeruginosa (43). Для последнего процесса переносу липидов может способствовать коническая форма, которая способствует слиянию везикул с мембраной клетки-хозяина (44).Здесь, объединив ³¹ P-ЯМР с моделированием МД, мы продемонстрировали, что DIM может принимать такую ​​коническую форму и способствовать образованию недислойных (перевернутых гексагональных) фаз мембраны (рис. 3), структур, важных для эффективного слияния мембран (45 ). Слияние мембран также может быть важным для герметизации фагосомной мембраны на последней стадии фагоцитоза. Примечательно, что наши результаты показали, что даже DLiPE, сильный усилитель недислойных фаз, не соответствовал силе DIM в продвижении недислойных структур (рис.5). Это может быть объяснено тем фактом, что липиды DIM преимущественно агрегируют в переходные стебли (Fig. 3 B и Movie S1), чтобы стабилизировать их, тем самым усиливая образование недислойной фазы. Эта форма также может быть принята другими липидами с длинной ацильной цепью, которые важны для инфекции Mtb (2) и переносятся на мембрану клетки-хозяина (40), такими как моно- и димиколат трегалозы и фенольные гликолипиды, молекулы структурно связаны с DIM. Хотя коническая форма является общей для липидов PE и DIM, мы выделяем дополнительное отличительное свойство липидов DIM.Высокая гидрофобная природа DIM может сдерживать агрегацию этих липидов между двумя листочками (как видно на фиг. 3 B, и 4 и SI, приложение , фиг. S4 A ). Эта локализация может дестабилизировать ламеллярную фазу ( SI Приложение , рис. S4 B ), как это было недавно замечено для других аполярных липидов (46, 47), в то же время способствуя разделению других липидов, таких как PE (как показано на Рис. 4), которые могут снизить энергетические барьеры активации: например, для слияния клеток.

В настоящее время имеется достаточно доказательств того, что липиды могут модулировать структуру и функции мембранных белков (48) и функции (49, 50). Как видно из липидов, таких как диацилглицерин (51), коническая форма DIM может модулировать активность мембранных белков. Соответственно, мы обнаружили, что DIMs увеличивают неопсонический фагоцитоз зимозана, процесс, который, как хорошо известно, опосредуется репертуаром мембранных рецепторов, включая рецептор комплемента 3 (CR3) (39) и рецептор маннозы (52). DIM может действовать на мембранные белки посредством различных биофизических механизмов.Во-первых, DIM может вызывать кривизну на мембране хозяина (12), что, в свою очередь, может модулировать интегральную сортировку мембранных белков (53, 54) и функцию (55). DIM также может запускать реорганизацию липидных нанодоменов для модуляции сигнальных платформ (14, 56). Таким образом, наши открытия должны открыть возможности для понимания того, как Mtb разрушает другие рецепторы, участвующие в его распознавании иммунной системой (57), включая Toll-подобные рецепторы, NOD-подобные рецепторы и рецепторы лектинов C-типа.

Модуляция активности мембранных белков в конечном итоге модулирует клеточные функции.Действительно, мы показали, что DIM способствуют инфицированию Mtb (рис. 6). Чтобы подтвердить актуальность конической формы, мы показали, что конические липиды POPE, но не цилиндрические липиды POPC, добавленные к макрофагам, также восстанавливают инфекционную способность DIM-дефицитного мутанта Mtb и улучшают фагоцитоз (рис. 6). Наши результаты также проливают свет на предыдущие наблюдения, показывающие, что мутант Mtb с дефицитом DIM, покрытый липидом трипальмитина, был менее эффективен в заражении макрофагов, чем мутанты, покрытые DIM (8).Теперь это можно понять по тому факту, что трипальмитин не способствует образованию межслойного фазового перехода в наших модельных мембранах (рис. 5) и, следовательно, не имеет сильной конической формы. Наши результаты показывают, что коническая форма липида способствует фагоцитозу. Влияние конической формы DIM на дезорганизацию мембраны также может играть роль в индукции разрыва фагосомной мембраны и гибели клеток (58, 59). В целом понимание того, как молекулярная форма липидов DIM и их биофизические свойства влияют на биологические мембраны, может помочь в разработке терапевтических стратегий, ориентированных на хозяина, для борьбы с туберкулезом (60), предотвращая инфицирование макрофагов Mtb .

Материалы и методы

Антитела, липиды и реагенты.

Кроличьи поликлональные антитела против микобактерий получали, как описано ранее (8). Конъюгированные с родамином красным вторичные козьи антитела против кроличьих вторичных антител и агглютинин зародышей пшеницы (WGA), конъюгат Alexa Fluor 350, были приобретены у Invitrogen. DIM были экстрагированы из Mycobacterium canetti ( SI Приложение , Дополнительные материалы и методы ). 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфохолин (16: 0-18: 1 PC, POPC), 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфоэтаноламин (16: 0-18: 1 PE, POPE), 1-стеароил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфохолин (18: 0-18: 1 PC, SOPC), 1,2-диолеоил- sn — глицеро-3-фосфоэтаноламин (18: 1-18: 1 PE, DOPE), 1-пальмитоил-2-гидрокси- sn -глицеро-3-фосфохолин (16: 0 лизоPC), 1,2-дилинолеил- sn -глицеро-3-фосфоэтаноламин (18: 2 PE, DLiPE), холестерин и яичный сфингомиелин были приобретены у Avanti Polar Lipids (Алебастр, Алабастр).Трипальмитин был приобретен у Sigma-Aldrich. Остальные реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich, если не указано иное.

Сбор данных ЯМР.

Спектры ЯМР фосфора регистрировали на спектрометре Bruker Avance с полосой 500 МГц, в зонде HRMAS, с дейтериевым замком. Образцы липидов [обычно 6 мг общих липидов в 50 мкл Трис-буфера (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4)] вставляли в 4-миллиметровые роторы со сферическими вставками. Температуру образца можно было варьировать от 278 К до 324 К и регулировать в пределах ± 0.1 K с блоком переменной температуры Bruker. Для калибровки температуры использовалась известная температурная зависимость химических сдвигов метанола. ³¹ Анизотропия химического сдвига (CSA) P была определена из вращающихся коллекторов боковых полос при частоте вращения 2000 ± 1 Гц. Спектры MAS были получены с помощью последовательности спинового эха (π / 2-τ-π), где импульс π / 2 имел длительность 5,3 мкс (при мощности 107 Вт), приложенный на частоте изотропного резонанса липидов, и задержка между импульсами τ составляла 20 мкс.Время выдержки составляло 1 мкс, время сбора данных 65 мс, задержка релаксации 1 с и количество сканирований 4096. Во время сбора данных не применялась протонная развязка, поскольку было показано, что она не влияет на ширину линии при частоте вращения 2 кГц (то есть намного выше ¹ H- ³¹ P диполярной связи ∼500 Гц в жидких липидных бислоях. ). Для каждого образца был получен спектр ЯМР ¹ H при частоте вращения 10 кГц, чтобы откалибровать ¹ H (с использованием пика метилена при 1.25 частей на миллион [ppm] относительно TMS) и ³¹ P химических сдвигов (относительно фосфорной кислоты при 0 ppm, используя γ _P / γ _H = 0,40480742). Наблюдаемые сдвиги изотропных химических веществ ³¹ P составляли -1,00 ± 0,02 частей на миллион для головной группы фосфатидилхолина (в SOPC) и -0,27 ± 0,02 частей на миллион для головной группы фосфатидилэтаноламина (в DOPE) и лишь незначительно варьировались в зависимости от исследуемых липидных составов. Типичная ширина линии составляла от 40 до 60 Гц (т.е. ~ 0,25 ppm), так что диаграммы боковых полос PC и PE были хорошо разрешены и могли быть подобраны независимо.

Каждый образец липосом уравновешивали в течение ночи при 277 К перед измерениями ЯМР. Затем мы измерили его спектр MAS ³¹ P при температурах от 284 K до 324 K с шагом 2 K каждые 100 минут (25-минутное уравновешивание плюс 75-минутное время сбора данных для каждой температуры). Было показано, что для липидных смесей, которые не претерпевают пластинчатого фазового перехода в обратно-гексагональный (т.е. с небольшой долей ДОФЭ), спектры полностью обратимы при понижении температуры от 324 К до 284 К.Однако после образования фазы H _II она не переходила в пластинчатую фазу, по крайней мере, после 1 дня уравновешивания при 284 К. Следовательно, все измерения проводились для повышения температуры, начиная с самой низкой температуры, соблюдая осторожность. поддержания липосом при низкой температуре во время их приготовления и перед измерениями ЯМР. Фактический выход DIM в липидные бислои определяли с помощью ¹ H-ЯМР ( SI Приложение , Дополнительный текст ).

Спектральная деконволюция.

Мы проанализировали каждый вращающийся коллектор с боковой полосой ³¹ P, используя инструмент анализа формы сплошной линии (SOLA), доступный в Topspin 3.5. Параметры CSA были рассчитаны с использованием соглашения Хэберлина для значений анизотропии Δδ = δ _// — δ _⊥ , как это обычно делается в литературе по мембранам и как объяснялось ранее (61). Мы оценили неопределенность значений Δδ в ± 0,2 ppm на основании нескольких измерений и подгонки, выполненных на независимых образцах.Сначала мы определили параметры CSA липидов, организованных в одну фазу (например, SOPC для ламеллярной фазы L _α и DOPE для фазы H _II ) при нескольких температурах от 284 K до 324 K. Параметры CSA для каждый липид и каждая фаза слегка и линейно изменялись с температурой из-за увеличения движения при более высоких температурах: от 49,6 ± 0,2 частей на миллион (293 К) до 45,0 ± 0,2 частей на миллион (333 К) для SOPC в фазе L _α ; и от -22,2 ± 0,2 частей на миллион (278 К) до -20,1 ± 0.2 ppm (333 K) для ДОФЭ в фазе H _II . Были получены следующие линейные регрессии: Δδ = −0,0944 T + 76,599 для SOPC в фазе L _α и Δδ = −0,0409 T −33,627 для DOPE в фазе H _II , где T — температура в Кельвинах; эти регрессии использовались для расчета значений CSA при промежуточных температурах. Поскольку липиды в фазе H _II испытывают дополнительное усреднение движения из-за боковой диффузии вокруг водных каналов, их CSA получается путем усреднения 2 компонентов, δ _// и δ , разделенных на 2, по обсуждаемым причинам. Куллиса и Де Крюиффа (62).Значения CSA в фазах L _α и H _II имеют противоположные знаки. Следовательно, значение CSA для SOPC в фазе H _II было принято равным -0,5 от его значения в фазе L _α , в то время как значение CSA для DOPE в фазе L _α было в 2 раза больше его значения в фазе . H _II фаза. Знание зависящих от температуры параметров CSA для обоих липидов в обеих фазах позволило резко сократить количество параметров, которые необходимо подбирать при анализе липидных смесей, в которых две фазы сосуществуют.После оптимизации положений пиков и ширины линий алгоритм подбора SOLA должен только найти те пропорции L _α -H _II , которые лучше всего воспроизводят экспериментальные спектры. Интенсивность вращающейся боковой полосы на +4 кГц является хорошим показателем доли фазы L _α , поскольку этот пик почти отсутствует в типичном многообразии боковых полос вращающейся фазы H _II (63) (рис.5 C ). Этот протокол подгонки был очень надежным и предотвращал артефакты и нестабильность, возникающие из-за подбора слишком большого количества параметров.Следует подчеркнуть, что наша процедура основана на предположении, что спектры состоят из линейной комбинации спектров 2 липидов в фазах L _α и H _II , имеющих параметры CSA, идентичные их значениям в чистых фазах. при той же температуре. Этого упрощающего предположения было достаточно для характеристики фазовых переходов липидов, хотя мы не можем исключить, что реальное поведение липидов является более сложным.

МД Моделирование.

Атомистическое моделирование МД проводилось с помощью программы Amber16 (64) (http: // ambermd.org) в сочетании с Lipid14 (65) и общим силовым полем AMBER (Gaff) (66). Система содержала мембрану из 300 молекул POPC и была сольватирована с моделью воды TIP3P с использованием сервера CHARMM-GUI (67, 68). Молекула DIM была расположена в бислое POPC с полярным остовом в непосредственной близости от атомов кислорода POPC (рис. 2 A ). Чтобы избежать стерических столкновений молекулы DIM с POPC, система была первоначально минимизирована путем выполнения 1500 итераций алгоритма наискорейшего спуска (SD), за которыми следовали 1500 итераций алгоритма сопряженного градиента (CG) со слабо ограниченным растворенным веществом (k = 10 ккал / моль / Å ² ).Затем был проведен короткий прогон МД длительностью 100 пс для слабо удерживаемого растворенного вещества с температурой, линейно изменяющейся от 0 до 303 К. Температурный контроль был достигнут с использованием динамики Ланжевена с параметром частоты столкновений γ, равным 1,0 пс ^-1 . Шаг интегрирования, использованный в этом прогоне, составлял 1 фс. В расчетах использовалось ограничение в 10 Å для электростатических взаимодействий. Моделирование МД продолжалось уравновешиванием системы, состоящим из 10 последовательных шагов МД по 500 пс каждый, при постоянной температуре 303 К без ограничений, с шагом интегрирования 2 фс.Затем был запущен производственный цикл на 800 нс при постоянном давлении 1 бар. Для контроля температуры использовалась динамика Ланжевена с γ = 1.0 пс ^-1 , а давление контролировалось анизотропным баростатом Берендсена с временем релаксации давления τ _p = 1 пс. Связи с участием водорода ограничивались алгоритмом SHAKE.

Крупнозернистое моделирование проводилось с использованием GROMACS 2016 (69) с силовым полем MARTINI 2.2 (70, 71). Мы разработали компьютерную модель DIM, следуя исходной стратегии параметризации MARTINI (72).Мы аппроксимировали от 3 до 4 тяжелых атомов, составляющих длинные гидрофобные ацильные цепи, на 1 частицу C1. Небольшие метильные разветвленные части были аппроксимированы небольшой частицей SC1. Слегка полярный конец цепи фтиоцерина был аппроксимирован частицей N ₀ , тогда как фрагменты сложного эфира глицерина были представлены частицей Na с промежуточной гидрофобностью, как это обычно делается для других фосфолипидов (фиг. 2 B ). Силовые константы и значения равновесия для связей и углов были извлечены из атомистического моделирования ( SI Приложение , рис.S3). Сначала все системы были постепенно уравновешены, как это было предложено в протоколе CHARMM-GUI MARTINI Maker (73). Кулоновские взаимодействия обрабатывались с использованием потенциала реакционного поля, а взаимодействия Леннарда-Джонса — с использованием сдвинутых потенциалов с радиусом отсечки 1,1 нм. Для плоских систем из чистого SOPC, молекул DIM / DLiPE, встроенных в бислой POPC или состоящих из смеси POPC / POPE / холестерина / сфингомиелина (с молекулами DIM и без них), давление поддерживали на уровне 1 бар с использованием алгоритма Парринелло – Рахмана. (74) с семиизотропным регулированием давления.Температура поддерживалась на уровне 310 К с использованием алгоритма v-rescale (75). Для чистых систем DOPE, SOPC / DOPE, POPC / POPE / холестерин / сфингомиелин и POPE / холестерин / сфингомиелин, претерпевающих пластинчатый переход в гексагональный, мы использовали протокол, описанный Marrink и Mark (27). Мы сложили 4 мембраны с уровнем гидратации от 2 до 3 водных CG-частиц на липид (что эквивалентно примерно 9-10 атомистическим молекулам воды), чтобы увидеть фазовый переход за разумное время, как подробно описано Марринком и Марком. (27).Использовали термостат Берендсена в сочетании с баростатом Берендсена (76). Было приложено полностью анизотропное давление муфты с эталонным давлением 1 бар. Системы были уравновешены при 280 K, а затем было запущено от 8 до 11 различных симуляций с температурами в диапазоне от 280 K до 380 K (в зависимости от исследуемой системы) с шагом 10 K. Во всех CG-системах шаг по времени составлял 20 fs использовалась. См. SI Приложение , Таблица S1 для краткого обзора моделирования. Параметры для CG и атомистических представлений липидов DIM будут доступны на веб-сайте MARTINI cgmartini.nl и по адресу https://github.com/MChavent. Профили плотности были выполнены с использованием инструмента плотности Gromacs (http://manual.gromacs.org/documentation/2016/onlinehelp/gmx-de density.html). Профиль бокового давления был рассчитан с использованием модифицированной версии Gromacs: Gromacs-LS (http://www.mdstress.org). Рисунки МД моделирования были выполнены с использованием VMD (77). Скрипты, используемые для анализа моделирования MD, доступны по адресу https://github.com/MChavent.

Динамическое моделирование исполнительного механизма из диэлектрического эластомера конической формы

В этом разделе разработана динамическая модель ДЭА конической формы.Для простоты изложения заранее заявлены три различных состояния DEA. Первое состояние называется недеформированным состоянием, второе состояние называется предварительно растянутым состоянием, а третье состояние называется электродеформированным состоянием, диаграммы которого показаны на рис. 1 (a), 1 (b) и 1 (c). ), соответственно.

(А) В недеформированном состоянии

Мембрана DE толщиной d ₀ зажимается рамкой с внутренним радиусом окружности R . Несущая пластина радиусом R ₀ размещается в центре ДЭ мембраны.Две стороны DE-мембраны, которые представляют собой две кольцевые области, покрыты податливыми электродами. Таким образом, радиальная длина ДЭА составляет L ₀ = R — R ₀ .

(B) Предварительно растянутое состояние

Гирю массой м. размещают по центру несущей плиты. Под действием силы тяжести P гиря переместится вниз на расстояние z ₁ , чтобы достичь положения равновесия.В результате мембрана DE предварительно растягивается до конической формы. Как показано на рис. 1 (b), L ₁ , d ₁ и h ₁ — это размеры DEA, соответствующие предварительно растянутому состоянию, где L ₁ — длина образующей, d ₁ — толщина, а h ₁ — разница высот между верхней и нижней поверхностями.

(В) Электродеформированное состояние

Когда на электроды подается управляющее напряжение Φ, DE-мембрана уменьшается в толщине и расширяется по площади.Таким образом, груз сместится вниз на расстояние z ₂ . Как показано на Рис. 1 (c), размеры L ₂ , d ₂ и h ₂ соответствуют электродеформированному состоянию.

Объемы DEA для недеформированного состояния, предварительно растянутого состояния и электродеформированного состояния составляют: (1)

Строго говоря, деформация ДЭА конической формы неоднородна [26, 27]. Однако для упрощения динамического моделирования неоднородность деформации игнорируется в следующих разработках [24, 28].Поскольку ДЭА несжимаем [29], объем ДЭА постоянен. Таким образом, V ₀ = V ₁ = V ₂ . Из (1) получаем (2)

Согласно (2) отношения между z ₁ , z ₂ , d ₁ и d ₂ равны (3)

DEA, изучаемый в данной статье, имеет коническую форму. Для простоты описания образующая, толщина и протяженность по окружности используются для описания состояний DEA.В предварительно растянутом состоянии предварительные растяжки DEA составляют _{до , L} , λ _{до , d} и λ _{до , C} , соответственно. В электродеформированном состоянии удлинения DEA равны λ ₁ , λ ₂ и λ ₃ соответственно. Согласно рис.1, выполняются следующие уравнения: (4) (5)

Согласно (2) — (5) устанавливается следующее уравнение: (6)

Зависимость между зарядом Q и напряжением Φ равна (7) где ε и C — диэлектрическая проницаемость и емкость материала DE соответственно.

Согласно (3) — (6), соотношение между δλ ₁ и δz ₂ составляет (8)

Из (6) и (7) заряд на электроде изменяется на (9)

Для расчета работы сил инерции во время электромеханической деформации мы рассматриваем цилиндрические координаты, показанные на рис. 2, где O , r , φ и z представляют начало координат, радиальное расстояние, азимутальный угол и высота цилиндрических координат соответственно.

Как показано на Рис. 2 (b), исследуется бесконечно малый элемент с внутренним радиусом r ₁ и внешним радиусом r ₁ + dr ₁ . В электродеформированном состоянии смещение элемента в направлении r , φ и z составляет 0, 0 и z _{r 1} соответственно. Итак, связь между z _{r 1} и z ₂ составляет (10)

Силы инерции в каждом элементе материала вдоль направления r , направления φ и направления z составляют 0, 0 и dF _{r 1} , соответственно.Согласно принципу Д’Аламбера, мы можем получить (11) где ρ — плотность материала ДЭ.

Таким образом, изменения работы сил инерции равны 0, 0 и δH _{I , z} соответственно. Согласно (10) и (11) работа силы инерции dF _{r 1} равна (12)

Изменение свободной энергии DEA равно сумме работ, совершаемых движущим напряжением, силой тяжести и силами инерции.Это, (13) где W, — плотность свободной энергии DEA, а δW представляет собой изменение W .

Подавая (9) и (12) в (13), плотность свободной энергии W изменяется на (14)

Подставляя (8) в (14), мы можем получить (15) где (16)

Для описания вязкоупругости материала DE принята реологическая модель с двумя параллельными блоками (как показано на рис. 3) [30]. Часть A состоит только из пружины α ₀ , в то время как часть B состоит из четырех параллельных образований, каждая из которых состоит из пружины α _i ( i = 1, 2, 3, 4, …, n ) с торпедо с последовательным заводом.В этой статье мы предполагаем, что каждый дроссель представляет собой ньютоновскую жидкость с вязкостью η _i . Пусть ξ _ij ( j = 1, 2) — растяжения из-за упоров, растяжения пружины α _i определяются правилами умножения, и.

Плотность свободной энергии W DEA [29] может быть описана как (17) где W _s — это свободная энергия Гельмгольца, связанная с растяжением эластомера, а D — это электрическое смещение.Электрический рабочий объем D равен (18)

В этой статье мы выбрали модель Гента [17, 30] для описания плотности упругой энергии DEA. Следовательно, плотность упругой энергии ДЭА равна (19) где — плотности упругой энергии пружины α _i ; μ _i — модуль сдвига пружины α _i соответственно; J _i — пределы деформации пружины α _i соответственно.

Согласно (5) — (7) и (17) — (19) плотность свободной энергии ДЭА равна (20)

Согласно третьему закону движения Ньютона, напряжения пружины α _i ( i = 1, 2, 3, 4,…, n ) равны соответствующим напряжениям демпфера. Так, (21)

Из (19) и (21) скорости деформации дашпотов можно выразить как (22)

Время вязкоупругой релаксации T _i ( i = 1, 2,…, n ) DEA определяется как отношение η _i к μ _и .Так, (23)

Подавая (20) в (15) и комбинируя результат с (22), динамическую модель конического DEA можно описать как (24)

На данный момент мы разработали динамическую модель для описания внутренней нелинейности, сложной электромеханической связи и зависящего от времени вязкоупругого поведения конического DEA. В следующих работах мы проводим эксперимент для получения экспериментальных данных конического DEA, а затем используем алгоритм дифференциальной эволюции для определения неопределенных параметров в (24) на основе этих данных.

Weller ST7 Паяльное жало конической формы 1/32 дюйма

Номер детали производителя:

Номер детали TestEquity:

Ваш номер детали:

Вес брутто (фунты):

Состояние:

Производитель:

Предложение штата Калифорния 65

{{section.sectionName}}:

{{option.description}}

{{section.sectionName}} Выберите {{section.sectionName}}

{{styleTrait.nameDisplay}} {{styleTrait.unselectedValue? «»: «Выбрать»}} {{styleTrait.unselectedValue? styleTrait.unselectedValue: styleTrait.nameDisplay}}

По ценам звоните: (800) 950-3457

На заказ:

Срок поставки производителя:

Ед / м:

Множественное количество продаж

КОЛИЧЕСТВО

• Атрибуты
• Документы
• {{спецификация.nameDisplay}}
• Атрибуты
• Документы
• Информация о ценах

доля

Электронное письмо было успешно отправлено.Электронное письмо не было отправлено, проверьте данные формы.